二、淋巴细胞功能测定

2020-09-09

来源:浙江体彩

(一)T细胞功能检测

1.淋巴细胞转化试验

原理:T细胞在特异性抗原或有丝分裂原的作用下转变为淋巴母细胞(体积更大、代谢旺盛),根据其转化程度和转化率,测定机体细胞免疫功能状态。

刺激物分为两类:

(1)非特异性刺激物:如各种丝裂原(PHA、Con A、LPS等),抗CD2 、CD3 等细胞表面标志的抗体以及某些细胞因子等;正常人T细胞转化率约为70%。

(2)特异性刺激物:主要是特异性可溶性抗原、细胞表面抗原、结核菌素(OT或PPD)。正常人T细胞转化率为5%~30%。

不同刺激物可刺激不同淋巴细胞分化增殖,从而反映不同淋巴细胞亚群的功能状态。

测定方法:可采用放射性核素掺入法、比色法、荧光素标记法和形态学等方法。

(1)3H-TdR掺入法

在T细胞增殖过程中,胞内DNA、RNA合成增加,应用氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)可掺入细胞新合成的DNA中,所掺入放射性核素的量与细胞增殖水平成正比。借助液体闪烁仪测定样品的放射活性,可反映细胞的增殖状况。该法灵敏可靠,应用广泛,但需特殊仪器,易发生放射性污染。

(2)MTT法

MTT是一种噻唑盐,化学名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑,其掺入细胞后可作为胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物,形成褐色甲臜颗粒并沉积于胞内或细胞周围,甲臢生成量与细胞增殖水平成正相关。甲臢可被盐酸异丙醇或二甲基亚砜完全溶解,借助酶标测定仪检测细胞培养物OD值,可反映细胞增殖水平。该法灵敏度不及3H-TdR掺入法,但操作简便,且无放射性污染。

(3)形态学计数法

淋巴细胞受丝裂原刺激后,转化为淋巴母细胞,其形态和结构发生明显改变,通过染色镜检,可计算出淋巴细胞转化率。

2.淋巴细胞参与的细胞毒性试验(LMC-T)

CTL、NK细胞可直接杀伤不同靶细胞(如肿瘤细胞、移植供体细胞等)。通过检测杀伤活性可用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面研究。

(1)51 Cr释放法

用Na51 2 CrO4 标记靶细胞,被效应细胞杀伤的靶细胞释放51 Cr,应用γ计数仪测定所释出的51 Cr放射活性,可反映效应细胞的杀伤活性(图10-26)。

图10-26 Cr释放法细胞毒试验

(2)乳酸脱氢酶(LDH)释放法

效应细胞-靶细胞进行反应并离心,借助比色法测定靶细胞膜受损后从胞内所释放出的乳酸脱氢酶活性,其水平反映效应细胞的杀伤活性。

(3)细胞凋亡检查法

效应双色球中奖概率细胞介导靶细胞凋亡时,内源性核酸水解酶将靶细胞DNA在核小体单位之间被切断,产生180~200bp(核小体单位长度)及其倍数的寡核苷酸片段,在琼脂糖电泳中呈现阶梯状DNA区带图谱,借此可反映细胞凋亡。

如需测定凋亡细胞数目及细胞类型,可在细胞培养物中加入末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,TdT)和生物素标记的核苷酸,TdT能在游离的DNA 3’端缺口连接标记的核苷酸,利用亲合素-生物素-酶放大系统,在DNA断裂处显色,从而指示凋亡细胞。该法所用标记核苷酸多为dUTP,故称TUNEL法(TdT dependent dUTP-biotin nick end labelling)。

3.分泌功能测定

检测免疫细胞所分泌细胞因子和抗体水平,可反映机体免疫功能状态。

(1)细胞因子分泌细胞的测定

细胞因子分泌细胞的测定常采用反向溶血空斑试验(RHPA)和酶联免疫斑点试验(ELISPOT)。RHPA检测原理是:将分泌细胞因子的待测细胞置于经SPA包被的单层SRBC中,抗细胞因子抗体被SPA固定在SRBC表面,并与待测细胞所分泌细胞因子结合。在补体存在时,细胞因子及其抗体形成的复合物可激活补体,溶解附近的红细胞形成溶血空斑。空斑大小与细胞分泌细胞因子的量成正比。

(2)抗体形成细胞测定

抗体形成细胞测定常用溶血空斑试验和定量溶血分光光度测定法。

溶血空斑试验即测定针对SRBC表面已知抗原的抗体形成细胞数目。其原理是:抗体形成细胞分泌的Ig与SRBC表面抗原结合,在补体参与下出现溶血反应。每一空斑中央含一个抗体形成细胞,空斑数目即为抗体形成细胞数(图10-27)。亦可采用RHPA和ELISPOT法检测抗体分泌细胞。

定量溶血分光光度测定法原理:根据溶血空斑试验原理衍化而来。将绵羊红细胞免疫小鼠后获得的脾细胞(含抗体形成细胞)与绵羊红细胞(SRBC)及豚鼠新鲜血清(补体)按一定比例混合,37℃水浴1小时后,SRBC溶解,释放血红蛋白,离心后上清液中的血红蛋白可用分光光度计定量测定。所获上清液吸光值与抗体形成细胞(浆细胞)分泌的抗体量成正比。

图10-27 溶血空斑试验

(1)直接溶血空斑试验法:检测分泌IgM的抗体形成细胞(图10-28)。

图10-28 直接溶血空斑试验作用机制示意图

(2)间接溶血空斑试验法:检测分泌IgG或其他类别Ig的抗体形成细胞。

方法:前两步与直接法相同,第三步需加入抗IgG或其他抗抗体,再加豚鼠新鲜补体进行观察(图10-29)。

图10-29 间接溶血空斑试验作用机制示意图


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